XIX Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología (APANAC 2023) - Panamá

Aislamiento, e identificación de Amebas de Vida Libre de unidades dentales y aires acondicionados de una Clínica Odontológica. Fase II.

Castillo Mabel

Universidad de Panamá, Escuela de Tecnología Médica, Facultad de Medicina
[email protected]

Gómez Tania

Universidad de Panamá, Departamento de Microbiología Humana, Facultad de Medicina

[email protected]

Ying Argentina

Universidad de Panamá, Departamento de Microbiología Humana, Facultad de Medicina

[email protected]

https://doi.org/10.33412/apanac.2023.3948

Abstract

Free-living amoebas (AVL) are protozoans with a wide environmental distribution, reported mainly in water, soil, ducts and biofilms. Some species of the genera Acanthamoeba, Naegleria, Balamuthia and Sappinia are amphizoic and can cause pathologies such as primary amoebic meningoencephalitis (PAM), amoebic granular encephalitis (GAE), and amoebic keratitis in humans and animals. Even though cases of infection with pathogenic AVL are of very low frequency or low morbidity, their high mortality represents a potential risk in environments in which there are clinical interventions with invasive processes, or immunocompromised patients. The presence of AVLes is expected in any humid environment, however, it is important to determine if they represent a risk to human health. In a previous study, AVL were isolated in dental units and air conditioners of a dental clinic, which were only identified morphologically in the genus Acanthamoeba. These amoebas were kept in the stock collection of the Department of Microbiology of the Faculty of Medicine. In phase II of the study, the molecular and physical-chemical identification of the free-living amoebas that were kept in the stock collection of the Department of Human Microbiology was carried out. during the pandemic and the determination of the levels of osmotolerance and thermotolerance they presented. Molecularly, the AVL of the strain corresponded to the genus Acanthamoeba. The four strains were thermotolerant and not osmotolerant. This study represents the first report of the presence of free-living amoebas in dental units and air conditioners in Panama.

Keywords: Free-living amoebas, osmotolerance, thermotolerance

Resumen

Las amebas de vida libre (AVL) son protozoosde amplia distribución ambiental, reportados principalmente en agua, suelos, ductos y biofilms . Algunas especies de los generos Acanthamoeba, Naegleria, Balamuthia y Sappinia, son anfizoicas y pueden causar patologías como la meningoencefalitis amebiana primaria (PAM), Encefalitis granulosa amebiana (EGA), y queratitis amebiana en humanos y animales. Aún cuando los casos de infección con AVL patogénicas son de muy baja frecuencia o baja morbilidad, su alta mortalidad representa un riesgo potencial en ambientes en los que hay intervenciones clínicas con procesos invasivos, o pacientes inmunocomprometidos. La presencia de AVLes de esperarse en cualquier ambiente húmedo, sin embargo, es importante determinar si representan un riesgo para la salud humana. En un estudio previo se aislaron AVL en unidades dentales y aires acondicionados de una clínica odontológica, que solo fueron identificadas morfologicamente en el genero Acanthamoeba. Estas amebas se mantuvieron en el cepario del Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina..En la fase II del estudio se procedio a la identificación molecular y fisico química de las amebas de vida libre que se mantuvieron en el cepario del departamento de Microbiología Humana durante la pandemia y a la determinación de los niveles de osmotolerncia y termotolerancia que presentaban . Molecularmente las AVL del cepario correspondireron al género Acanthamoeba. Las cuatro cepas fueron termotolerantes y no osmotolerantes. Este estudio representa el primer reporte de la presencia de amebas de vida libre en unidades dentales y aires acondicionados en Panamá.

Palabras claves: amebas de vida libre, osmotolerantes, termotolerante.

Materiales y Métodos

A Cuatro cepas identificadas morfológicamnete dentro del género de Acanthamoeba (340, 130, 420 y ERX1) en la fase I, se le hicieron pruebas de termotolerancia y osmotolerancia y a dos cepas identificadas morfológicamnete como genero Acanthamoeba se les hizo PCR y secuenciación.

Examen microscópico

Se utilizó un microscopio invertido para la observación de AVL de los cultivos tanto de ANN como de los cultivos para la termotolerancias y osmotolerancia. Se tomó como referencia la forma y tamaño de quistes, características de endoquiste y apariencia de trofozoítos de acuerdo a la clave de Page (1976).

Cultivo axénico

Las muestras aisladas y los pases de cepas conocidas fueron cultivadas en ANN suplementados con cepa 35218 de Escherichia coli al 0.5 de McFarland, se incubaron 48 horas a temperatura ambiente, luego donde se observaron crecimiento amebiano, se transfirió a un medio axénico con aproximadamente 5mL de medio de crecimiento PYG, compuesto por peptona, extracto de levadura y glucosa.

Termotolerancia

En placas de agar no nutritivo suplementadas con cepa 35218 de Escherichia coli inactivadas por calor con suero fetal, se colocó un inóculo de aproximadamente 1000 amebas que fueron contadas en cámara de Neubauer con 10ul de cada cepa. Las placas se incubaron a ٣٠°C, ٣٧°C y ٤٢°C realizando revisiones de ٢٤, ٤٨ horas y una semana mediante el uso de un microscopio invertido. Como control se utilizó una placa de ANN bajo las mismas condiciones descritas previamente y e incubándose a temperatura ambiente.

Finalizado el tiempo de incubación, el crecimiento final se evaluó cualitativamente, mediante la observación de la presencia tanto de trofozoítos como de quistes, registrándolo como +/- (presencia de quistes positiva o negativa), +/- (presencia de trofozoítos positiva o negativa) e interpretando el crecimiento abundante como +++, el moderado como ++, y el nulo -. Luego que se cumplió el tiempo, se tomó en cuenta lo siguiente: la observación de la presencia de trofozoítos al igual que su multiplicación, presencia de una vacuola pulsátil activa y la distribución fuera del punto de inoculación inicial en toda la placa de ANN.

Osmotolerancia

Para el estudio de la osmotolerancia se utilizaron placas de ANN con manitol en concentraciones de 0.3M, 0.5M y 1.0M suplementadas con Escherichia coli inactivadas por calor con suero fetal. En el medio de las placas se inocularon aproximadamente 1000 amebas contadas en cámara de Neubauer con 10ul de cada cepa. Todas las placas se realizaron por triplicado. Como control se emplearon placas de ANN sin manitol bajo las mismas condiciones. Para confirmar la presencia y crecimiento de las amebas en las placas se utilizó el microscopio invertido transcurridos 24, 48 y 72 horas.

Se consideró como resultado positivo la observación de un diámetro superior a unos 5mm del punto de inoculación inicial.

Extracción de ADN.

Se trabajaron dos cepas de un estudio anterior a la cual ya le habían realizado las pruebas fisicoquímicas, para ello se utilizó una prueba comercial que consiste en unir el ADN a una membrana de gel de sílice (kit comercial QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook).

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Para la amplificación del ADN de AVL después de un lavado con 2ml de solución salina, se recogió la suspensión en tubo eppendorf de 1.5ml, se centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se vuelvió a resuspender en 500ul con solución salina para la posterior extracción de ADN.

Secuenciación

Los amplicones purificados empleados en el PCR se secuenciaron por la casa comercial Macrogen en la sede Corea del Sur.

Para el análisis de datos, se utilizó el software SnapGene, la base de datos NCBI, Blastn y Clustal OMEGA.

Resultados

Las cuatro cepas obtuvieron un crecimiento amebiano a temperaturas de 37ºC y 42ºC, la cepa 130 y ERX1 a las 24 horas, y las cepas 340 y 420 con un crecimiento a la semana.

Conclusiones

El crecimiento de las cuatro cepas a distintas concentraciones de osmolaridad y a temperaturas mayores de los 35ºC, sugiere un posible potencial patogénico de las amebas del genero Acanthamoeba, encontradas.

Las cuatro cepas trabajadas no tuvieron crecimiento en concentración de 3.0M.

La identificación molecular por PCR a las cepas 680 y 630 confirmó la presencia de amebas del genero Acanthamoeba.

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